Привет, Человек! Меня зовут Диджи – я открою тебе дверь в мир волшебства!
Данная ветка поможет тебе в выращивании волшебных грибов - сохрани на заметку ;)
Многим чашки Петри кажутся бесполезным инструментом. А потом шрумер теряет и отпечаток, и единственную инокулированную банку с плесневелым зерном, оставаясь у разбитого корыта…
В чем проблема:
У тебя есть споровый отпечаток. Согласно всем обучалкам по грибам, он одноразовый (да, ты можешь использовать только 10-20% отпечатка - но в этом случае шанс попадания заразы на материал кратно повышается. Поэтому я рекомендую использовать сразу весь, но распределить его на бОльшее кол-во зерна или ЖМ).
Так вот если ты занес заразу самостоятельно или отпечаток тебе отправлял гаражный шрумер – твой гров обречен… Спустя 1-2 недели ты обнаружишь заражение в банках, а попытки перенести здоровый мицелий скорее всего не увенчаются успехом и ты получишь месяц чистейшего стресса, с потерей всего грибного материала, по итогу :(
Чашка Петри тебе поможет:
1 – сохранить и размножить грибную культуру (перенося стерильный мицелий на субстрат)
2 – проверить материал на стерильность (споры и ЖМ)
3 – изолировать нужный штамм грибов (при мультиспоровом отпечатке)
4 – сохранить грибную культуру в малом объеме, на долгий срок
(5 – почувствовать себя микробиологом корпорации Umbrella :wideyed: )
Конечно, если ты пробуешь вырастить что-нибудь "по приколу" – все эти заморочки тебе ни к чему. Но если ты психонавт-мечтатель, который хочет не просто потреблять, но и дарить жизнь уважаемому виду, который был со страхом заказан из даркнета в единсвенном экзампляре, с которым нельзя ошибиться – сегодня я расскажу как не заруинить вообще все, по цене шаурмы ;)
Тебе нужно:
- Стекляная чашка Петри (заказать с Озона)
- Агар-агар (мы используем Биологический, но тебе подойдет и Пищевой)
- Микроволновка\кастрюля\скороварка\автоклав\духовка
Не буду разъяснять, что такое Агар – найдешь в любой википедии. Эта штука превратит сладкую воду в желе и поможет тебе выцепить любую частичку мицелия, вплоть до 1 нити (гифа).
Плотность агара может быть разной, поэтому его соотношение с водой лучше всего подбирай эксперементально (благо, на тесты уходит буквально пара минут). После остывания, у тебя должно получиться желе, которое не будет смещаться при наклоне посуды (полностью застынет).
В качестве основы, я предлагаю использовать пшеницу как самое популярное зерно для проращивания (на овсе делаем по аналогии).
Делаем зерновой отвар
Варишь пшеницу для банок, как обычно, но воду в конце не сливаешь. Берешь поварешку и набираешь верхний слой воды, чтобы было без осадка. Желательно воду дополнительно отфильтровать, пропустив через несколько слоев ткани. На 1 Чашку , димаетром10см, нужно 40-50мл жидкости. Если отвара получилось меньше, чем ты планировал, его допустимо разбавить обычной водой, до нужного объема.
Делаем агаровую среду
Зерновой отвар ставь на огонь и хорошенько разогрей. После, убавь огонь до минимума. Начинай засыпать агар медленно, как манку (если кинешь большой комок – он слипнется).
Помешивая, добейся полного растворения агара. Как только это произойдет – все готово. (На этом этапе ты можешь проверить правильность пропорций агара. Не остужай основной объем жидкости - возьми рюмку, набери в нее столовую ложку агара и поставь в холодильник на пару минут. Если застыло полностью - все гуд. Если получился кисель - добавь еще немного агара в раствор и повтори эасперимент)
Теперь время разлить горячий раствор по чашкам, толщиной слоя 3-4мм. Затем накрывай чашку крышкой.
Для подготовки к стерилизации и последующей работы, я рекомендую тебе завернуть каждую чашку в фольгу (загибай фольгу однообразно, чтобы ты потом без проблем понимал, где низ а где верх каждой чашки). Так ты образуешь стерильный кокон и сможешь обращаться с инструментами свободно.
Стерилизуем чашки Петри
В зависимости от девайсов, у тебя будут разные алгоритмы стерилизации. Подробно мы их рассмотрим в соответствующей теме, а тут я дам лишь нюансы.
1 – при нагреве, жидкость в чашках начнет испаряться. Твоя задача недопустить высыхания. Если ты стерилишь на пару – все четко, влажность нормализуется сама собой. Но если в духовке – нужно установить блюдце с водой. Если в микроволновке – не допускать перегрева (выключать через пару секунд после закипания).
Создание инокуляционной петли
Лично мы петлю практически не используем, поскольку есть более удобные методы для промышленного производства. Однако, об этом инструменте нужно рассказать, потому что это как “нитка с иголкой” – всегда в паре.
Бери самую длинную, какую сможешь найти, иглу (замечательно подходит "набор игл для шитья кукол").
Нагревай иглу до красна и молотком расплющивай 1-2см ее острия. Должен получиться плоский наконечник.
Зажми 5-7мм кончика иглы плоскогубцами и согни ее под 90 градусов (буквой Г).
Противоположный конец обматывай изолентой, для создания удобной ручки.
Инокуляция ЖМ (на производстве VOYAGE)
Этот пример будет показан без использовании инокуляционной петли (и фоток), однако на нашем производстве все происходит так: после набора ЖМ в шприц, первые капли спускаются в воздух – примерно пол куба (чтобы в дальнейшем по игле шел только 100% стерильный материал). Далее, поднимаем крышку чашки и капаем 3 капли в разные стороны Чашки (не касаясь иглой ничего). После, этим же шприцем инокулируются первые банки. Так, в случае заражения банок, мы сможем понять, на каком этапе возникла проблема. И если мицелий был стерилен – он у нас сохраняется и может быть вновь размножен, а проблема заключалась в субстрате. Если и в Чашке пошло заражение, значит ЖМ не стерилен и вся банка выбрасывается, без лишних затрат времени и ресурсов.
Инокуляция споровым отпечатком
Поскольку у нас масштабы оптовые, отпечатки мы проверяем так же, как в примере выше – делаем споровую взвесь, первые капли отдаем Чашке, а последующими инокулируем питательный раствор для ЖМ. Но речь не об этом. Приступаем к работе! В первую очередь, ты должен быть в максимально стерильном помещении (как этого добиться будет в соответсвующей ветке). Расставь все инструменты как тебе удобно (порепетируй, прежде чем работать с настоящим материалом!!!)
Петлю накаливай до красна, над пламенем горелки, затем погружай в спирт.
Далее, подноси петлю к горелке – она начнет гореть. Пока это происходит, перемещай ее к Чашке.
Слегка приоткрой крышку, не смещая ее и окуни иглу в агар. Это нужно по 2 причинам: игла станет липкой и ты охладишь ее до безвредной для спор температуры.
После этого, приоткрыв пакетик с отпечатком, возьми с него часть спор (если отпечаток хороший – хватит 1 прикосновения чтобы собрать тысячи спор. Если отпечаток бледный – можешь поскрести по нему, не касаясь пакетика.)
Далее, сразу переносим материал обратно в Чашку, слегка приоткрыв ее (как на фото 4). Достаточно коснуться Агара в нескольких местах.
Изолирование и маркировка
Оберни чашку в несколько слоев пищевой пленки, чтобы недопустить проникновения посторонних организмов! Обязательно промаркируй чашку – напиши на ней дату и вид гриба. Если были косячки в процессе, то укажи и их, чтобы не грешить только на материал, если он окажется заражен.
Инкубация
Ставь чашки в темное, теплое место (+27), на весь период инкубации.
Желательно поставить чашку вверх дном, чтобы испаряемая влага оседала внизу и не стекала на Агар, создавая риск заражения. Через 3-10 дней споры начинают прорастать, образуя белый пух. Мицелий любого другого вида или консистенции (например пленка, или слизь) является явным признаком заражения и должен быть немедленно удален!
Очаги мицелия могут появляться не только в местах, контакта с инокуляционной петлей, но и по всей поверхности агара. Это происходит потому, что пока Вы совершали манипуляции внутри чашки Петри, некоторые споры упали с инокуляционной петли сами по себе, и теперь они проросли.
Если во время инкубационного периода, заражения среды посторонними микроорганизмами не происходит, через 3-4 недели, мицелий полностью осваивает поверхность агара.
Хранение культур
После того, как мицелий полностью освоит поверхность агара, чашки Петри убирают на хранение в холодильник. При температуре +3-5С процессы жизнедеятельности мицелия замедляются, и он может сохраняться в таких условиях несколько лет. В течение этого времени мицелий постепенно поедает питательную среду, поэтому, чем толще был ее слой, тем дольше мицелий сможет питаться.
По мере надобности, чашки Петри с мицелием достают из холодильника и отрезают кусочки агара для проведения инокуляции или для пересадки культуры на свежую питательную среду.
Для проведения инокуляции отрезают небольшой (~ 1х1 см) кусочек агара с мицелием и помещают его в емкость с субстратом. Через несколько дней мицелий перебирается на субстрат и постепенно осваивает его целиком.
Длительное хранение культур
Для длительного хранения культур, удобно использовать пробирки со скошенным агаром. Готовую среду разливают по пробиркам, закрывают их ватно-марлевой пробкой, и после стерилизации, пока агар не застыл, устанавливают в наклонном положении - скашивают агар. После того как агар застынет, пробирки инокулируют мицелием, дожидаются полного обрастания поверхности агара, и убирают на хранение в холодильник.
Длительность хранения при этом, достигается за счет уменьшении площади роста мицелия и увеличении толщины питательного слоя (по сравнению с чашкой Петри).
Удаление заражения
Если во время роста мицелия, произошло заражение среды посторонними микроорганизмами, необходимо как можно быстрее отделить чистый мицелий, от конкурирующей микрофлоры.
В случае "точечного заражения", (когда очаг заражения небольшой и локализован в одном месте), его проще вырезать и выбросить, оставив не тронутой основную часть мицелия.
Опять же, перед процедурой убеждаемся в стерильности помещения, рабочего места и всех инструментов (включая руки).
Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусок агара, с растущей на нем плесенью, подцепляем его кончиком скальпеля и удаляем.
Чашку Петри с удаленным очагом заражения оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место, на весь период инкубации - смотри фото аналогичных действий при проведении инокуляции.
Пересадка мицелия
В случае, когда посторонняя микрофлора занимает значительную часть, и вырезать ее не представляется возможным, из зараженной чашки Петри извлекают кусочек агара с чистым мицелием, и пересаживают его на новую среду в другую чашку Петри. Аналогичные действия совершаем и просто при переносе мица на новую среду.
Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусочек агара с чистым мицелием (чем меньше и точнее будет разрез, тем лучше), подцепляем его кончиком скальпеля и переносим на новую среду, в другую чашку Петри.
Чашку Петри накрываем, подписываем, оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место на весь период инкубации - смотри фото аналогичных действий при проведения инокуляции.
Через несколько дней, пересаженный кусочек опушится мицелием, а еще через несколько дней мицелий переберется на новую среду. Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через 3-4 недели, мицелий полностью освоит поверхность агара.
На этом статья по чашкам Петри окончена. Я рекомендую тебе не пренебрегать данным методом, пока ты работаешь в домашних условиях, с подручными инстурментами. Это своеобразный “бэкап” твоей культуры. Желаю тебе не сталкиваться с заражением и всегда предусматривать такую тонкую работу на 2 шага вперед!
До скорых встречь в космосе! ;)
